影响因子9.043丨分享一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的mcr-1检测方法

质粒介导的可移动粘杆菌素耐药酶（mobilized colistin resistance，mcr-1）基因可导致耐药株的快速传播，给人类感染的治疗带来极大威胁。本研究将RPA与CRISPR/Cas12a系统相结合，建立了一种新的快速检测mcr-1基因的方法，命名为RPA-CRISPR/Cas12a，并阐述了该方法在无菌培养和模拟样品中的特异性和敏感性。

· 基于RPA-CRISPR/Cas12a的mcr-1检测

含有PAM位点（TTTC）的目标基因段被RPA试剂盒在37℃的等温条件下扩增（图1，步骤1和2）。由重组酶和特异性引物结合形成的重组酶-引物复合物可以在双链DNA模板中寻找同源序列。当模板的特异性序列被识别后，链式交换反应将被启动，目标片段将在DNA聚合酶的作用下被成指数级扩增。在检测阶段，gRNA-CRISPR/Cas12a复合物通过PAM位点识别目标序列（图1，步骤3），成功激活效应分子Cas12a。然后，被激活的Cas12a蛋白切割目标序列，同时在反应体系中实现探针（用荧光团标记的ssDNA）的非特异性反式切割（图1，步骤4至6）。最后，荧光信号被释放出来，可以作为检测结果的指标被收集。

RPA-CRISPR/Cas12a检测的整个诊断过程，包括基因组提取（15分钟）、RPA反应（30分钟）、CRISPR/Cas12a裂解（5分钟）和荧光检测（10分钟），可以在1小时内完成（图2）。

使用参考菌株（E. fergusonii WH-ZX154）的连续稀释液评估了RPA-CRISPR/Cas12a系统的检测极限。CRISPR-mcr-1检测按上述方法执行，并通过检测荧光信号获得结果。最后，通过三次平行试验，该系统甚至可以稳定地检测420 fg的质粒DNA。为了分析RPA-CRISPR/Cas12a系统的特异性，提取了携带各种抗性基因（KPC-2、NDM-1、IMP-26、OXA-181、rmtB、qnrS1、TEM-1B和sul1）菌株的DNA。与这些非mcr-1物种相比，只在产生mcr-1的样本中检测到阳性信号。RPA-CRISPR/Cas12a技术的阳性预测值（PPV）、阴性预测值（NPV）、敏感性和特异性都是100%。因此，开发的RPA-CRISPR/Cas12a系统可以专门监测mcr-1基因。