影响因子12.545丨PADLOCK：利用液滴微流控技术实现微滴式数字RPA的绝对核酸定量

 

 

研究背景

重组酶聚合酶扩增（RPA）被认为是一种很有前途的核酸检测等温扩增方法。然而，由于RPA 的MgOAc起始反应特征和固有的非特异性扩增，RPA的数字格式仍然难以实现。在此，开发了一种叫作PADLOCK的方法，利用液滴微流控技术实现微滴式数字RPA（ddRPA）的绝对核酸定量。通过将微流体注射器与液滴发生器耦合，将反应引发剂镁MgOAc加入含有不含MgOAc的RPA母料的液滴中，用于控制数字反应解锁，完全避免了过早放大。在受限液滴中将目标离散到单分子水平，可以对拷贝数进行绝对定量。与CRISPR/Cas13a传感相结合，ddRPA在30分钟内显示出单分子检测能力，显著提高了信噪比和均匀的荧光信号报告，有助于核酸的精确定量。此外，Padlock-CRISPR方法的实用性已在22个临床样本中得到验证，其结果与qPCR结果100%一致。

 

 

研究思路和结果

  • · PADLOCK核酸定量分析方法的开发

PADLOCK的数字量化过程包括三个步骤，包括液滴分配和反应引发、孵化和可视化。对于每种传感策略，首先制备相应的MgOAc剥夺反应主混合物，并将其分配为油包水液滴，随后将其与引发剂MgOAc一起给药以进行数字反应解锁。将所得液滴乳液在37℃下孵育，并最终进行荧光测量和计数。为了评估定量能力，我们在10 cp/μl至106 cp/μl的范围内，使用三种传感方案进行了PADLOCK分析。所有实验重复三次。

 

 

图1. RPA与Cas13a、exo探针和EvaGreen传感的工作机制

 

注：在Padlock-CRISPR中，Cas13a基于靶标和crRNA之间的互补碱基对实现了高度特异和可编程的检测。首先用RPA扩增靶DNA，然后与T7转录结合，将扩增出的DNA靶标转化为RNA，供Cas13a随后检测。Cas13a效应器被限制在微孔室中，通过将特定靶序列的存在转化为多转换核酸酶活性（即辅助活性），作为优雅的信号放大器发挥作用，这使得RNA报告子能够被切割，并导致特异性和强烈升高的信号报告。在Padlock-EXO中，Exo探针包含一个荧光团、一个猝灭剂和一个四氢呋喃残留物。靶DNA经RPA扩增后，外源探针与互补靶结合。然后，探针中的四氢呋喃残基被DNA切割。在PADLOCK-EVA中，在没有DNA的情况下，EvaGreen采用环状构象，保持非荧光。当RPA启动并放大DNA靶标时，EvaGreen改变构象并与dsDNA结合以发射荧光。

 

 

 

由于受到非特定背景噪声的影响，导致大量假阳性液滴，因此无法提供定量结果。以NTC组作为检测限，PADLOCK-EVA的理论检测限约为9500 cp/μl。图2a和2c显示了Padlock-CRISPR和Padlock-EXO一系列浓度的典型终点荧光图像，显示了输入浓度和阳性液滴比率之间的明显一致性。随后分析并比较了PADLOCK-RISPR、PADLOCK-EXO的定量结果（图2b和2d），两种方法均表现出高度灵敏的核酸定量能力，在测量浓度和预期浓度之间具有良好的线性响应。两种方案都成功地检测并量化了低至10 cp/μl的目标浓度。然而，在10 cp/μl的低目标浓度输入下，量化结果显示出一些不确定性，这可归因于稀释过程的不准确。

 

与PADLOCK-EXO相比，PADLOCK-CRISPR实现了更均匀和一致的液滴荧光信号报告，具有明显的S/N比，而PADLOCK-EXPO中的荧光信号性能更容易受到非特异性反应和背景干扰。另外，Exo探针传感和EvaGreen传感在液滴限制内表现出较差的兼容性，并导致一定量的沉淀，这可能会影响测定和荧光读数。

 

随着报告物浓度的增加，PADLOCK-CRISPR的S/N比急剧增加，呈现出阴阳液滴之间的明显分离。这主要归因于激活的Cas13a的持续反式切割活性，其消化了受限液滴中存在的大多数可用报告物，产生高度均匀和升高的荧光信号。而对于PADLOCK-EXO，含有目标的液滴的荧光信号水平受到Exo探针可结合的可用扩增子数量的限制，导致不一致的报告效率，S/N比增强有限。

 

总之，PADLOCK-CRISPR和PADLOCK-EXO都具有较高的敏感性、特异性、反应速度和准确性，是具有吸引力的核酸定量候选技术。特别是PADLOCK-CRISPR，具有高S/N比、均匀的信号报告和一致性。此外，Cas13a的强旁系活性使ddRPA具有可调的荧光S/N比，有助于核酸的精确定量。

 

 

图2. PADLCOK核酸定量分析

 

注：(a)(c)液滴的荧光显微镜图像显示PADLOCK-RISPR和PADLOCK-EXO测定结果的终点。比例尺为200μm。(b)(d)使用PADLOCK-CRISPR和PADLOCK-EXO测量的浓度作为预期浓度的函数。这些数据是从三个单独的实验中获得的。指示数据的线性拟合。

 

 

 

 

· 临床样本中PADLOCK-CRISPR检测的评估

通过对PADLOCK分析的全面调查，因为PADLOCK-CRISPR的总体性能卓越，我们确定其是下一代诊断工具最有前途的候选者。为了验证PADLOCK-CRISPR检测的实用性和实用性，我们进一步将其应用于定量分析临床患者样本中的HPV16病毒载量。将定量浓度与热图中的qPCR定量结果进行比较，结果显示在30分钟的总运行时间内与平行qPCR结果100%一致（图3a）。PADLOCK-RISPR在所有14个阳性样本中成功检测到HPV16 DNA，最高Ct值约为33，而在所有阴性对照中均未检测出HPV16 DNA（图3b和3c），显示出PADLOCK-CRISPR在临床诊断中的巨大潜力。

 

 

图3. 患者样本对PADLOCK-CRISPR的临床验证

 

注：(a)热图显示了使用PADLOCK-CRISPR和qPCR的临床样品的定量结果。颜色的饱和度对应于定量的HPV病毒载量水平。(b)从14个阳性患者样本中提取的DNA的qPCR Ct值。(c)PADLOCK-CRISPR在22个临床样本检测中的性能结果，显示与qPCR结果100%一致。

 

 

 

等温扩增原料酶-M-MuLV反转录酶

 

M-MuLV反转录酶（Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase，M-MuLV RT） 是一种RNA依赖的DNA聚合酶，可用于长mRNA（>5kb）为模板的cDNA合成。本产品 M-MuLV由一个分子量为71 kDa的亚单位组成。

本产品M-MuLV具有以下几种活性：依赖于 RNA的DNA聚合酶活性；依赖于DNA的DNA聚合酶活性；RNase H活性。本产品有极佳的热稳定性，活性范围为37℃~65℃，且在55℃中，残留活性接近100%。

M-MuLV反转录酶还可用于RNA的逆转录反应、第一条链cDNA的合成、cDNA Probe的制备、RT-PCR反应、Real Time RT-PCR反应。并经高效液相色谱（SEC-HPLC）和SDS-PAGE检测，纯度高达95%以上。

 

 

 

参考文献：

Cui JQ, Liu FX, Park H, et al. Droplet digital recombinase polymerase amplification (ddRPA) reaction  unlocking via picoinjection [J]. Biosens Bioelectron. 2022 Apr 15; 202: 114019.