影响因子9.618丨DESCS系统：BstUI/Hhal、RPA和CRISPR/Cas13a联合系统提供高效可靠的定点甲基化检测

DNA甲基化的高效检测对肿瘤的诊断和治疗具有重要意义。在此，作者首次提出了DESCS系统，可以准确和灵敏地检测位点特异性DNA甲基化。DESCS系统结合了双重甲基化敏感限制性内切酶和RPA联合CRISPR/Cas13a的独特功能，不仅为超高灵敏度的甲基化DNA检测提供了快速而强大的信号放大效率，而且有效地消除了未甲基化靶标不完全消化的假阳性影响。更重要的是，通过这个系统 0.01 %的甲基化水平可以有效地与过量的非甲基化DNA区分开来。此外，DESCS分析被集成到侧向流动层析技术（LFB）中，用于DNA甲基化的即时检测。鉴于DESCS系统具有灵敏度高、选择性好、操作简便等优点，将为甲基化的位点特异性分析提供可靠的检测方法。

• RPA 辅助CRISPR/Cas13a的机制

DESCS法整合了BstUI/Hhal核酸内切酶对未甲基化胞嘧啶的高度特异性，以及RPA和CRISPR/Cas13a系统强大的信号放大效率（图1）。

• DESCS检测的可行性

为了验证DESCS法检测SEPT9-mC甲基化的可行性，将RPA产物进行T7转录扩增并使用CRISPR/Cas13a系统识别剪切，结果发现甲基化的SEPT9-mC DNA产生了很高的荧光强度。相反，未甲基化的SEPT9-C DNA表现出可以忽略的荧光强度，与空白组一致。这些结果表明，未甲基化的SEPT9-C DNA被双内切酶系统消化，不能启动随后的RPA、T7转录扩增和CRISPR/Cas13a反应；而甲基化的SEPT9-mC DNA成功地触发了RPA辅助的CRISPR/Cas13a系统，这说明DESCS方法可以区分甲基化的SEPT9-mC和未甲基化的样品。

• DESCS检测的性能

作者采用了DESCS检测不同浓度的甲基化SEPT9-mC以验证灵敏度。结果显示在0.01-100%浓度的SEPT9-mC DNA荧光强度随着SEPT9-mC DNA甲基化水平的增加而增加（图2），尤其是0.01%的SEPT9-mC DNA也可以通过DESCS检测完全区分，说明DESCS检测法在甲基化检测方面具有很高的灵敏度。

为了进一步确定DESCS检测法对SEPT9基因位点特异性甲基化的鉴别能力，使用SEPT9-C DNA和其他随机DNA作为干扰物，用DESCS检测法进行测定。结果发现存在SEPT9-mC DNA的情况下，有明显的荧光强度。相反，SEPT9-C DNA和其他三种干扰物引起的荧光信号可忽略不计（图3）。这些结果表明，DESCS方法对DNA甲基化检测具有良好的特异性。

• 利用侧向流动层析技术（LFB）检测DNA甲基化

为了做成可视化的系统，将DESCS集成到侧向层析装置中进行甲基化分析。在未甲基化的情况下SEPT9-C DNA被双内切酶系统消化，不能启动DESCS系统反应。而甲基化的DNA可以触发RPA反应和T7转录，产生大量的ssRNA，从而激活CRISPR/Cas13a系统将报告因子切割，导致仅与FAM结合的gold-NP-anti-FAM抗体受到检测线上捕获抗体的限制，有两个明显的甲基化检测条带。并且，随着SEPT9-mC DNA浓度的增加，条带呈现从无色到深色的渐变。除此以外，研究发现SEPT9-mC DNA的浓度为200 aM时可以明显区分，表明基于DESCS系统的LFB法具有超高的灵敏度。除SEPT9-mC DNA外，所有测试的干扰物均未出现色带，表明基于DESCS系统的LFB法在甲基化检测方面具有突出的特异性。

• 结论

DESCS检测结合了双甲基化敏感限制性内切酶（BstUI/Hhal）、RPA和CRISPR/Cas13a系统，因此具备了BstUI/Hhal系统的高特异性和强大的消化能力及RPA和CRISPR/Cas13a系统无可比拟的扩增效率，可用于SEPT9基因的定点甲基化检测。无论是在过量还是微量非甲基化DNA中，0.01%的SEPT9基因均可以被有效检出。在此基础上，建立了基于DESCS系统的侧向层析技术，实现了对DNA甲基化的即时检测，检测限可达200 aM，具有可视化的特点。

— 东抗相关产品推荐 —

 

 

扫码关注我们

 

微信号｜East-Mab

国内领先的蛋白原料供应商